关于选择血栓前状态实验诊断指标的建议
关于选择血栓前状态实验诊断指标的建议
关于选择血栓前状态实验诊断指标的建议
中华医学检验杂志 1998年第5期第21卷 *血栓与止血检测标准化*
作者：王淑娟
单位：100034 北京医科大学第一医院
一、血栓前状态的定义
血栓前状态(prethrombotic state, PTS)既往称血液高凝状态(hypercoagulable state, HCS)，是多种因素引起的止血、凝血和抗凝系统失调的一种病理过程，具有易导致血栓形成的多种血液学变化。PTS颇为常见，各种血液及非血液疾病时均可见到，如多颗粒性早幼粒细胞白血病、肾病综合征、糖尿病及恶性肿瘤等。大量的基础和临床研究工作表明、血栓形成是在血管内皮细胞、血小板、凝血、抗凝、纤溶系统以及血液流变学等多种因素改变的综合作用下发生的，这些因素在血栓形成之前已发生不同程度的变化。因此，通过有关检测有可能识别血栓前状态，这对及时加以处理，防止其发病无疑具有重要的临床意义。血栓前状态的诊断条件是：(1)有某些特异性血栓前状态化验指标阳性结果为据。(2)用针对性药物或手段进行治疗处理后，能减低血栓发生率，异常的化验指标有所改善乃至恢复正常。以下针对血栓前状态时的血凝学变化，首先提出综合性筛选指标，然后针对与血凝学有关的各个方面提出分级的综合性特异性实验诊断指标，供参考。
二、PTS的实验诊断指标
1.综合性筛选指标：(1)血浆凝血酶原时间(APTT)及活化部分凝血活酶时间(PT)测定：PTS时可能缩短。(2)血小板聚集功能试验(ADP诱导)：PTS时可能最大聚集率增高。(3)血浆纤维蛋白原含量测定：PTS时可能＞4 g/L。(4)体外血栓形成试验：测量血栓长度、湿重、干重，尤其是干重，在成人＞27 mg一般视为增高。(5)血液粘度测定：PTS时血液粘度可能增高，测全血粘度时应取高切(200 s-1)、中切(40～50 s-1)和低切(＜10 s-1)三个切变率，同时测红细胞比积。测血浆粘度时取高切变率进行。
2.特异性实验诊断指标：(1)一级综合性特异性指标：反映血管内皮细胞受损的化验指标：血浆vWF:Ag测定。vWF为凝血Ⅷ因子中Ⅷ：C的载体蛋白，主要由内皮细胞合成并贮存于其胞质内的Weibel-Palade小体中。血浆内含量不多，当内皮细胞受损时释放入血增多，导至血浆中的vWF：Ag含量增高。PTS时可见增高。反映血小板被激活的化验指标：血浆血小板球蛋白(β-TG)测定(ELISA法)。β-TG为由血小板α颗粒合成并分泌的一种血小板特异性蛋白质，当血小板被激活时由α颗粒中释放出来入血，导致血浆中含量增高。反映凝血酶生成增多的化验指标：①血浆纤维蛋白肽A(FPA)测定。凝血酶作用于纤维蛋白原之后，首先从其A(a)链的氨基端裂解下一对由1～16号氨基酸组成的小肽，即FPA，分子量为1 536。它是凝血酶作用于纤维蛋白原的早期产物，是反映凝血酶已形成的敏感指标。在取得特殊抗凝的血浆后必须立即测定，用ELISA法较方便。于PTS时含量常增高。②血浆凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物(TAT)测定。一旦凝血酶形成后，由于机体的调控和防御作用，迅速与AT-Ⅲ以1∶1摩尔浓度的比例关系结合成TAT以消除凝血酶的影响。TAT复合物的形成是凝血酶已生成的分子标志物，于PTS时TAT含量常增高。反映生理性抗凝物减弱的化验指标：AT-Ⅲ测定。AT-Ⅲ是血浆中最重要的生理性抗凝物质，约占血浆中总抗凝血酶活性的50%～70%。肝素作用于AT-Ⅲ的赖氨酸残基而使其抗凝血酶活性增强1 000倍。AT-Ⅲ是一种多功能的丝氨酸蛋白酶抑制物，除能抑制凝血酶之外，对Ⅸα、Ⅹa、Ⅺa、Ⅻa、Ⅶa、KK及纤溶酶等也有抑制作用。AT-Ⅲ测定分为AT-Ⅲ：Ag测定及AT-Ⅲ活性测定，前者可用免疫学方法；AT-Ⅲ活性测定用发色底物法。PTS时AT-Ⅲ活性可能减低。反映纤溶系统活性的化验指标：①血浆组织型纤溶酶原激活物(t-PA)测定。t-PA是纤溶系统主要的生理性激活剂，由血管内皮细胞合成贮存并释放入血，它能使纤溶酶原(pLG)转化为纤溶酶(plm)而降解和消除纤维蛋白凝块。当动脉粥样硬化等病变损伤血管内皮细胞时，t-PA的合成和释放减少以致纤溶活性降低是PTS的发病机制之一。②血浆纤溶酶原活化剂的抑制物(PAI)测定。PAI是t-PA的抑制物，它主要分为血管内皮细胞型(PAI-1)和胎盘型(PAI-2)。PAI-1主要由血管内皮细胞合成并释放入血，少量PAI-1来自血小板。血浆中的PAI主要为PAI-1，它能快速地以1∶1分子比例与t-PA形成复合物而使t-PA失活，故PAI活性增高常可致PTS。t-PA/PAI比值对判断PTS有一定参考价值。此比值的参考范围约为0.36±0.09。在PTS时此比值可因t-PA活性减低或PAI活性增高而减低。③纤维蛋白(原)降解产物(FDP和D-二聚体)测定。一般而言，在人体凝血系统被激活的同时，纤溶系统也被激活而形成纤溶酶，后者降解未交联的纤维蛋白(及纤维蛋白原)而产生FDP，它是反映体内纤溶活性总水平的参数。纤溶酶降解已交联的纤维蛋白而产生D-二聚体，后者含量的增高表明机体的凝血和纤溶系统的双重激活，是继发性纤溶亢进的敏感指标。(2)二级综合性特异性指标(可根据本单位条件选用)：反映血管内皮细胞受损的分子标志物：①血浆血栓调节蛋白(TM)测定。TM为一种膜糖蛋白，广泛存在于动、静脉，微血管内皮细胞的表面，由血管内皮细胞合成并分泌入血。它与凝血酶有很高的亲和力。正常人血浆中TM的含量很低，当血管内皮细胞受损时TM释放入血增多而致血浆TM含量增高。PTS时可见增高。②血浆内皮素1(ET-1)测定。ET-1由血管内皮细胞合成和分泌，当血管内皮细胞受损时释放入血增多而致血浆中含量增高。ET-1有强烈收缩血管作用而导致血流缓慢，促使PTS的形成。PTS时可见增高。反映血小板被激活的分子标志物：①血小板α颗粒膜蛋白-140(GMP-140，又称P-选择素)测定。GMP-140主要来自血小板α颗粒。血小板被激活时，随α颗粒的释放，其膜上的GMP-140经开放管道系统释放并整合到血小板质膜上而使此活化血小板表面的GMP-140分子数大为增加。用抗GMP-140的单抗经流式细胞仪或RIA可进行测定。在PTS时常可见增高。②血浆11-去氢血栓烷B2(DH-TXB2)测定。众所周知，血栓烷A2(TXA2)是血小板花生四烯酸代谢产物之一，亦属血小板活化的标志物。因其半寿期短，无法检测，故多测其进一步转化为已无生物活性的TXB2，但后者含量受多种体外因素的影响。已有文献报道，血小板在体外活化时产生TXB2的能力为300～400 μg/L，远高于TXB2的生理浓度(50～200 ng/L)，因此少量血小板在体外活化就可明显地增高血浆TXB2的含量。近年来已有检测血浆DH-TXB2的报道，DH-TXB2是由TXB2在体内形成的半寿期长的酶代谢产物，由于它只在体内血小板活化后产生而不在体外形成，故DH-TXB2测定是反映体内血小板活化的理想指标，且其半寿期长(45分钟)，易于检测。PTS时，血浆HD-TXB2含量常增高。(3)反映Xa、凝血酶原激活物增多的分子标志物：血浆凝血酶原片段1+2(F1+2)测定。当Xa乃至其与FV、PF3和Ca2+形成凝血酶原激活物之后，作用于凝血酶原的氨基端273位精氨酸和274位苏氨酸之间的肽键，使之断裂而生成前凝血酶和F1+2。正常人血浆中F1+2含量很低，血栓前状态早期凝血酶原激活物生成增多时，可见F1+2含量增高。(4)反映凝血酶生成亢进的分子标志物：主要有血浆蛋白C活化肽(PCP)测定。PCP是蛋白C在凝血酶-TM复合物作用下被激活时由其重链氨基端所释放的由12个氨基酸组成的酶性肽段。在凝血酶生成增多的PTS时，血浆PCP含量可增高。(5)反映生理性抗凝蛋白减弱的化验指标：①血浆蛋白C(PC)测定。PC为维生素K依赖性抗凝因子，其本身无酶活性，只有被凝血酶-TM复合物激活成人为活化的蛋白C(APC)时才有抗凝作用。后者的机制在于：APC可灭活Ⅷa和Va。APC有促进纤溶的作用。PC的含量或活性有缺陷可导致PTS或易栓症。遗传性PC缺陷症的发生率在成人为0.1%～0.5%，在血栓性疾患患者的发生率为2%～5%。PC的遗传性缺陷症分为两型：Ⅰ型者PC含量和活性均下降，其活性/含量比值≥0.75；Ⅱ型者其含量正常，活性下降，活性/含量比较＜0.75。②血浆蛋白S(PS)测定。PS亦为维生素K依赖性因子，主要具有以下功能：有加强APC对Ⅷa和Ⅴa的灭活作用；对补体激活有调节作用。血浆中PS的存在有两种形式：40%为游离型PS；60%与C4bp以1∶1非共价键形式结合成结合型。游离型PS能促进APC灭活Ⅷa、Ⅴa而起抗凝作用。遗传性PS缺陷症的Ⅰ型者其游离型PS含量及PS活性均减低，总PS含量减少。Ⅱ型者其游离型PS含量及总PS含量正常，PS活性减低。Ⅲ型者游离型PS含量及PS活性减低，而总PS含量正常。PS含量及活性减低时可导致PTS或易栓症。③活化蛋白C抵抗性(APC-R)检测。近年研究发现由于FⅤ缺陷而导致活化蛋白C(APC)不能灭活其Va致使APC不能发挥其抗凝作用，而该有缺陷的FV仍然具有凝血活性反而可导致血栓形成。因此APC-R的实际含义主要指具有抗APC裂解作用的Va。本实验属检测有缺陷的FV(FV Leiden)的筛选试验，本应列入凝血因子先天性缺陷的筛选诊断项目之中，但由于其检测方法中须用APC，故列于此处。APC抵抗性的检测方法主要有三类：? APC-APTT测定。? 发色底物法。? DNA分析法。APC-R的筛选性方法为APC-APTT测定，是以APTT为基础而建立的，它包括两个试验：
APC敏感比值(APC sensitivity ratio, APC-SR)测定。公式为：
APC-SR的参考值范围为2～5，＜2则可判断为APC-R阳性。
标准化APC-SR(normalized APC-SR，n-APC-SR)测定。公式为：
一般以＜0.84作为APC-R的临界值。FV Leiden杂合子的n-APC-SR为0.45～0.70，纯合子为＜0.45，符合此标准的个体应作DNA分析以确诊FV Leiden。国外报道80%的n-APC-SR值＜0.70的个体显示有FV基因1691位G→A突变，但国内所见并非如此，即在国人APC-R筛选性试验阳性个体中却少见FV Leiden。其原因尚有待进一步研究。
需要指出的是上述APC-R的筛选试验原理是基于APTT测定，因此所用试剂和方法必须标准化。另外还必须除外与APTT测定有关的凝血因子有异常和抗凝物质的存在。
发色底物法测APC-R是基于APC能灭活Ⅷa，从而限制了FXa的形成，使FXa生成减少进而影响FXa对有关底物的显色反应，通过检测FXa的酰胺水解活性来间接反映APC抗凝反应的能力。此发色底物法的优点是结果有量化的概念，且不受抗凝物或其它有关凝血因子改变的影响。据Varadi等报道，24例中有23例携带FV Leiden的深静脉血栓患者，用发色底物法测得的结果与其APC-SR值是一致的，但也有并不一致的报道。(6)反映纤溶亢进的分子标志物：①血浆Bβ1～42和Bβ15～42肽段测定。如前所述，凝血系统被激活的同时，纤溶系统也被激活。Bβ1～42和Bβ15～42肽段均属纤溶活性增强的早期产物。纤溶酶作用于纤维蛋白Ⅰ(纤维蛋白原失去一对FPA后的名称)，降解下Bβ1～42片段；纤溶酶作用于纤维蛋白Ⅱ(纤维蛋白原进一步失去一对FPB后的名称)，降解下Bβ15～42肽段，此二肽段均为纤溶酶活性增强的早期降解产物，PTS时可见血浆中此二肽段的含量增高。②血浆纤溶酶-α2抗纤溶酶复合物PIC)测定。由于纤溶系统中起核心作用的纤溶酶其半寿期极短，不便进行测定。既往常以血浆纤溶酶原含量下降和α2抗纤溶酶含量减低来推断纤溶酶活性的增强，晚近则转而测定PIC的含量，后者含量增高提示纤溶酶生成增多。在PTS时血浆PIC含量常见增高。
所有上述有关PTS的各种特异性化验指标，既有其相应的理论基础，又有或多或少的临床实际应用的经验，说明它们对PTS的诊断是有效的。但在此仍须强调指出，构成血栓前状态及血栓形成是一个十分复杂的病理过程，除受前述有关血凝学各方面因素的影响外，还与机体单核-巨噬细胞系统功能如何、神经体液和内分泌系统的调节情况如何等密切相关；与年龄、饮食习惯、药物影响、情绪状态、血脂及低密度脂蛋白的含量、血管弹性力学等有关；此外，机体对止血、凝血、纤溶等方面的变化力图通过复杂的正负反馈作用不断维持着动态平衡，故只有多种因素同时改变或某一种因素有严重改变时才可能形成血栓前状态。但改变或失衡到何种程度或失衡后多长时间才会有血栓形成?哪些化验指标能更及时判断其失衡?这些均属尚未解决的问题。因此急需止血血栓方面的临床专家与有关实验室专业人员共同拟定一些血栓前状态的初筛和特异性综合性实验诊断指标和应用计划，并以大协作的方式及时应用于临床，并不断总结经验，力求在较短时间内总结出我国初筛和诊断PTS的实验诊断方案来，以进一步加强对血栓性疾病的防治。
注：文中所列各项化验指标的参考值各实验室不尽相同，故一般均未列出，而仅指出它们在PTS时的可能变化