乳腺癌转移的部位决定了它们的克隆组成和可 [复制链接]

乳腺癌是一种异质性疾病，单个癌细胞转移和逃避治疗的能力不同。目前三阴性乳腺癌(TNBC)转移异质性以及转移过程中肿瘤细胞转相互作用网络尚未清晰。单细胞跟踪方法逐渐成为解开肿瘤内异质性的有力工具，基于LentiviralGeneOntology(LeGO)载体的opticalbarcoding，可以对肿瘤细胞异质种群(20-23)内的个体克隆进行空间跟踪。与geneticbarcoding相比，这种方法的关键优势是能够通过显微镜和流式细胞技术(FACS)在单克隆水平上对标记的种群进行成像、量化和排序，从而进一步进行分子特征分析。

作者在scRNA-seq技术基础上利用opticalbarcoding来探索三阴性乳腺癌(TNBC)背景下的转移异质性，为了研究TNBC细胞相互作用和适应这些器官的方式，优化了LeGO技术，在体内可视化和量化31个"barcodedclones"。实验结果表明，这种细胞跟踪策略不仅可以用高分辨率成像来比较器官间转移播种的动态，还可以识别与肺和肝脏转移相关的新部位驱动基因表达特征。

研究结果

1.使用BSVTK标记能够以单细胞分辨率跟踪31个带条形码的亚克隆

Geneticbarcoding缺乏内源性荧光报告器意味着单个克隆不能直接可视化，也不能通过流式细胞技术(FACS)来分离研究它们的分子特征。BSVTK可借助共聚焦成像和流式细胞技术(FACS)可视化和定量分析多达31个带条形码的亚克隆barcodedsubclones。在乳腺癌细胞MDA-MB-中，对个单细胞进行RNA测序(RNA-seq)分析，基于广泛的拷贝数变异(CNVs)推断基因组异质性(图1A)，含有单独BSVTK标签的LeGO病*感染了MDA-MB-细胞，使单个细胞能够整合每个荧光团的不同组合(图1B)。光谱分解用于专门分离五个荧光BSVTK标签的发射光谱，并生成五通道对焦图像(图1C)。虚拟31色图像通过测量每种颜色的体积进行量化。并计算每种颜色对整个图像群的相对贡献(图1CDE)。和FACS进行比较，BSVTK成像质量无明显差异，在接下来的56天里，我们观察到了一个渐进的克隆漂移，光学标签的数量在减少，一些barcodedsubclones在多个通道(图1F)中占据主导地位。总体而言，这些结果表明，光学标记的MDA-MB-细胞在基因组和表型水平上都具有一些异质性。

图1光条形码显示MDA-MB-细胞的异质性

2.原发性肿瘤中占主导地位的barcodedsubclones在转移中仍然占主导地位

为了深入了解转移过程中克隆分布的整体动力学信息，作者向NOD-SCID-IL2Rγ的乳腺脂肪垫中注入了BSVTK标记细胞c?/?(NSG)小鼠在达到mm时通过切除原发性肿瘤，允许转移性生长。通过影像学(图2A)和流式细胞术(图2,B和C)对原发肿瘤和转移瘤的条形码库进行比较，发现小barcodedsubclones和显性barcodedsubclones之间有很大程度的变异性。实验结果发现体外一些不太丰富的barcodedsubclones在体内占主导地位，在原发性肿瘤和转移部位(图2B，浅蓝色)中最据主导地位的subclones，占体外繁殖的所有细胞的近2%(图2B和C)

对肺部和肝脏转移barcodedsubclones的比较表明，这些器官之间的克隆异质性存在显著差异。这些结果表明，转移的亚克隆成分与转移部位的性质有关，肝脏比肺部更具选择性。

图2全器官单细胞分辨率下转移负荷的可视化和定量

3.转移灶内异质性取决于转移部位

由于大量的barcodedsubclones转移到肺部和肝脏，作者通过共聚焦成像，对例肺转移和例肝转移中的单个barcodedsubclone(图3,a和B)进行了量化，对数据集的分析显示，大部分肺和肝转移瘤是单色的，尽管我们注意到肺多色转移瘤的百分比(17%)明显高于肝脏(1.2%)(图3,A和B)。值得注意的是，17%的多色肺转移占肺转移负担的88.7%(图3A)。这一结果表明，尽管多色转移瘤数量较少，但多色转移瘤是该器官转移负担的主要贡献者。这种分布在肝脏中未观察到，多色转移仅占转移负担的4.5%。这一实验结果在所有小鼠中都得到了呈现。

图3肺和肝转移瘤的转移内异质性分析

4.单个条形码亚克隆在肺转移中具有不同的内在相互作用能力

先前的研究表明，癌症克隆能够在多克隆转移中相互作用。首先，作者研究了在单个肺和肝转移中观察到的异质性程度是否与肿瘤整体肿块相关(图4A)，得出肺病变的大小与每个病变的颜色数量呈正相关。相比之下，这种相关性在肝脏中没有观察到，无论病变大小，肝脏中只检测到少量多色转移(图3B和4A)。研究发现，虽然丰度是特定条形码亚克隆聚类的主要决定因素，但亚克隆的性质也可能产生影响(图4,B和C)。总的来说，这些结果表明亚克隆在转移瘤内共定位的可能性可能取决于它们的丰度、身份以及转移位点。

图4转移灶内克隆相互作用的定位

5.转移barcodedsubclones获得可逆的、特定位点基因表达特征

在3只小鼠中比较了条形码亚克隆2和13在肺、肝中的基因表达模式，以识别个差异表达基因的位点驱动特征，称为BSVTK特征集(图5B)。当考虑到本特征集中包含的所有基因时，原发肿瘤的轮廓与肺转移相比更接近肝转移(图5B)。从实验结果中推断，肺和肝脏转移之间的转录差异由克隆选择引起的可能性较小，而是由肿瘤微环境决定的。BSVTK特征集根据患者的恢复器官区分转移灶(图5D)，这种特征可能不仅局限于TNBC，基因型-组织表达(GTEx)数据集应用到健康人类肺和肝组织的转录组时，这组基因也足以在PCA中根据样本的组织来源来分离样本(图5E)。这表明，区分肺和肝转移的基因(图5,A到D)也能区分表型正常的肺和肝组织(图5E)。这些结果表明，乳腺癌细胞在它们所处的微环境中具有某些共同的转录组模式。

图5肿瘤微环境对转移亚克隆转录组景观的影响

6.肿瘤坏死因子–α途径在肺转移中受到强有力的调节

利用BSVTK数据集(图6A)、BROCADE数据集(图6B)和BSVTK数据集(图6B)进行的特征分析显示，与肝转移相比，肺中与典型核因子κB(NFκB)靶基因相关的肿瘤坏死因子-α(TNFα)信号通路显著上调。以及上述涉及亚克隆2的再移植实验(图6C)。同样，所有三个数据集也显示作为TNFα和nfκb介导的炎症反应一部分的炎症反应基因集表达升高。此外，(KEGG)数据库的富集分析证实，与肝转移相比，肺转移中相应的TNFα通路也显著上调(图6E)。

图6不同转移部位转录组变化相关分子特征的富集分析

研究结论

作者使用光学条码准确地检测、可视化和量化体内不同转移器官的次要和显性barcodedsubclones，发现在两个临床相关的转移部位，肺和肝脏，在克隆动力学和转录特征方面，特定亚克隆可以显示不同的行为。结果表明，与肝脏相比，在肺部检测到的条形码图谱具有高度异质性，不仅体现在器官间异质性水平上，而且在转移内异质水平上也是如此。通过映射单个肺和肝脏转移中条形码亚片的相互作用，发现与肝脏转移相比，肺转移具有高度的多色性。这表明，组织特异性肿瘤微环境可能决定相应转移的克隆异质性程度。这有助于理解肿瘤转移细胞对所给药物的差异敏感性，并为研究其他靶向治疗在不同微环境下对克隆相互作用和肿瘤生存的影响提供了希望。

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