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春晓
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Qi
#乳腺癌已成全球最常见癌症#
三阴性乳腺癌（TNBC）中，雌激素受体ER、孕激素受体PR、原癌基因HER-2全是阴性，因此治疗效果非常不好。这类患者存在一种显著的特征，即存在非整倍体，且携带TP53突变。这项特征是否能带来一些TNBC的治疗突破呢？首先要搞清楚基因组的稳定性问题，染色体在肿瘤长期的发展过程中何时重排、怎么维持？这种基因组不稳定性是否存在间断拷贝数的演变或者说是进化（punctuatedcopynumberevolution，PCNE）？人们还摸不清楚。先前研究已表明PCNE在三阴性乳腺癌患者中很常见，但彼时受测序技术的限制，没法深入研究PCNE在肿瘤发展过程中的变化。
不久前，来自MDAnderson的NicholasE.Navin团队以及来自哈佛医学院的FranziskaMichor团队在Nature杂志上合作发表了题为Breasttumoursmaintainareservoirofsubclonaldiversityduringexpansion的研究论文，在这篇文章中，作者报道了一项新技术，它相比于scDNA-seq能够进行更高通量的单细胞测序，以这项新技术，作者观察到了三阴性乳腺癌患者染色体是如何进化的这一基本问题。
作者开发的这套新方法称为声学细胞标记法（acousticcelltagmentation，ACT），它结合了单核荧光活化细胞分选（fluorescence-activatedcellsorting，FACS）、标记和声学液体转移技术（tagmentationandacousticliquidtransfer，ALT），以单分子分辨率进行高通量scDNA-seq（图1）。步骤包括包括：1）细胞核与组织的分离；2）通过FACS将单个细胞核分离到高密度孔板中；3）标记试剂的ALT；4）双条形码的文库构建；以及5）多重测序的单细胞文库的合并。
图1.ACT方法的示意图
作者通过对乳腺癌细胞进行的深度测序后印证ACT相较于现有的scDNA-seq方法大有进步。作者应用ACT对8个三阴性乳腺癌（TN1-TN8）和4个细胞系的个单细胞进行了拷贝数分析。结果确定了乳腺肿瘤由7-22个亚克隆组成，这些亚克隆组成3-5个主要的超克隆（图2）。其中，作者对亚克隆（subclones）与超克隆（superclones）也给出了自己的定义：“亚克隆”指的是具有高度相似拷贝数分布的细胞簇，代表来自单一基因型的克隆扩增；“超克隆”指的是具有拷贝数畸变（CNA）的亚克隆群的级别克隆。
图2.三阴性乳腺肿瘤（TN1-TN8）的单细胞拷贝数据聚类（其中轮廓代表超克隆，色点代表亚克隆）
接下来作者进行了外显子组测序和进化分析，发现了共同的进化谱系，在克隆性TP53突变、杂合性多重缺失和基因组加倍后，原发性肿瘤扩张过程中存在一段短暂的基因组不稳定期，随后是持续的拷贝数进化。这段基因组不稳定性升高的短暂时期比渐进进化模型更好地解释了患者数据。
作者还对具有TP53突变和非整倍体型乳腺癌细胞系，即MDA-MB-、BT-20、MDA-MB-和MDA-MB-进行了测序并对亚克隆进行了聚类分析，与原发性肿瘤相似，这四个细胞系有11-20个亚克隆，组成3-5个超克隆。同时，进化计算也在细胞系中证明了原发肿瘤中的短暂基因组不稳定性。此外，在这篇文章的扩展数据中，作者还证明了亚克隆拷贝数畸变对整个基因组中多个基因表达存在更广泛影响，在此基础上提出了三阴性乳腺癌进化的修正模型。
总的来说，这项研究补充了作者前一个发现中留下的遗憾，观察到了PCNE在肿瘤发展过程中的变化。ACT方法是对第一代scDNA-seq方法的重大技术改进。但作者仍然觉得自己的新方法还有不足之处：可能低估了克隆多样性，PCNE和亚克隆库可能不是三阴性乳腺癌患者独有的，可能存在于其他特别是含有TP53突变的非整倍体实体瘤中。期望未来ACT这项新技术能够在生物医学的不同领域中以及及非整倍体的研究中得到广泛的应用。
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